本文由馬爾文帕納科粒度應用專家劉曉華供稿

儀器：Zetasizer Ultra納米粒度電位儀

樣品池：使用小體石英樣品池(ZEN2112)測量樣品。使用MADLS測量顆粒濃度，可以得到粒徑大小分布和每個峰的濃度。測量時，需要用戶提供以下參數：

• 樣品材料：因為病毒衣殼是由蛋白質外殼制成，測量是以蛋白質作為樣品材料。

• 分散劑材料：最初分散劑設置為水，但隨后通過編輯顆粒濃度結果來修正粘度以獲得正確的尺寸和濃度。測量粒度的準確性對顆粒濃度的計算至關重要。緩沖液的粘度是用玻璃微珠來測量的^[1]。需注意，較大的顆粒散射更多，無需向樣品中大量添加。

• 緩沖散射計數率(背向散射角)：緩沖散射強度在用于測量的同一樣品池(ZEN2112)中測量，只需使用背向散射角設置單角度測量，并將測量位置設置在比色皿的中心。作為正常測量運行，導出的計數率值用于“緩沖散射”領域的顆粒濃度測量。

三次重復測量的運行時間小于4分鐘。

02丨測量結果

三種AAV樣品的粒徑大小分布如圖1，圖A至C所示。相應的顆粒濃度如圖2，圖D至F所示。圖1，圖A所示的ATCC AAV2參考樣品含有聚集體，這并不奇怪，因為該樣品是從冷凍中解凍的，由于可用體積小，直接插入試管中，沒有任何預過濾。然而，盡管存在聚集體，基于MADLS技術測量的顆粒濃度給出了一個濃度值(1.12 x 10¹²顆粒/ml)與衣殼酶聯免疫吸附試驗(0.92 × 10¹²粒/ml)相關良好。關于濃度更多細節見表1。對于Allergan的兩個AAV樣本，檢測到的聚集物少得多或為零，從表1中可以看出，兩個樣本中病毒峰值的濃度值與衣殼ELISA結果具有良好的相關性。

圖1 三個樣品中的每一個的三次重復測量如圖所示：圖A-ATCC AAV2參考樣品，圖B-Allergan AAV樣品1和圖C-Allergan ADP樣品2

圖2 與圖1中相同的三個樣品的三次重復測量的分布顆粒濃度：圖D-ATCC AAV2參考樣品、圖E-Allergan AAV樣品1和F-Allergan ADP樣品2

為了比較變化，取每次重復測量的濃度結果，計算標準差和平均值，以此計算%CV。

表1 三個樣品的衣殼ELISA測定濃度數據和基于MADLS的顆粒濃度結果；ATCC AAV2參考樣品、過敏原樣品1、過敏原樣本。2、所有濃度均以顆粒/毫升為單位。n=表示在三次重復測量中，有幾次測到了峰值。如果不存在群體峰值，則標注為n/a，即“不適用”。

比較表1的結果，ATCC AAV2參考樣本的病毒種群濃度值CV %最大。這是由于樣品中的聚集體影響了AAV峰值的確定程度。如果您將圖1A中的大小峰值可重復性與圖1B或1C中的其他病毒種群峰值進行比較，您可以看到后者覆蓋得更好，可重復性更高。這將直接影響濃度測量的重復性。兩種Allergan AAV樣品的峰值重復性約為15%，樣品中沒有或只有少量聚集物。      

結論：

所提供的數據表明，Zetasizer Ultra基于MADLS的顆粒濃度既可以提供AAV病毒樣本的大小分布，從而報告樣本聚集狀態，也可以提供有關主要病毒群的濃度和存在的任何聚集的信息。每次重復測量不超過4分鐘，樣品可以在試管內進行整個測量，因此污染的風險最小，暴露給操作人員的風險也最小。

作為最后的注意事項，在測試期間，確定使用正確的樣品粘度以確保最準確地測量顆粒濃度是很重要的。分散劑的粘度可以用粘度計測量，也可以在Zetasizer Ultra儀器中使用粒徑參考珠來測量^[1]。    

參考文獻：

[1] Determining Dispersant Viscosity Using Dynamic Light Scattering; Malvern Panalytical Application Note