根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IACR）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，僅2020年中國新發(fā)癌癥病例就高達457萬例，死亡病例300萬例，兩項數(shù)據(jù)皆高居全球第一。繼手術(shù)、放療、化療以后，細胞治療被稱為第四種腫瘤療法，2013年甚至被Science評為年度最有價值的科學(xué)突破之一，可以說21世紀(jì)是細胞治療的時代。

《Nature Reviews Drug Discovery》上發(fā)表的全球癌癥免疫療法分析表示，截止2021年4月16日，全球在研的活細胞治療藥物共計有2073種，其中CAR-T細胞療法新增的臨床管線高達到299條，新增幅度達到35%，在免疫細胞療法中名列前茅。中國和美國CAR-T細胞療法研發(fā)臨床試驗項目遠高于其他國家。據(jù)不完全統(tǒng)計，2020年，中國正在進行的臨床階段的CAR-T療法為36款，共計三百多個相關(guān)臨床項目在研。

什么是細胞培養(yǎng)？

細胞培養(yǎng)是指從動物或植物中提取細胞，然后在人工環(huán)境中進行培養(yǎng)以進行科學(xué)研究。最早的細胞培養(yǎng)技術(shù)是在100多年前開發(fā)的，為科學(xué)的巨大突破做出了貢獻。如今，它已成為全世界實驗室用于研究細胞的生理學(xué)、生物化學(xué)、疾病潛在機制以及藥物和有毒化合物的作用的基本工具。它也可用于在藥物篩選和大規(guī)模制造生物化合物，諸如疫苗和治療性蛋白質(zhì)。

 細胞所需的基本設(shè)備和試劑

要進行需要細胞培養(yǎng)工作的研究并進行基本的細胞培養(yǎng)方案，下表1和表2匯總了一些關(guān)鍵設(shè)備和一些基本試劑。

細胞培養(yǎng)所需的基本試劑

其他設(shè)備包括在層流罩中的抽吸泵，可輕松地從細胞培養(yǎng)容器中去除培養(yǎng)基和試劑；用于對設(shè)備和可重復(fù)使用玻璃器皿進行消毒的高壓滅菌器；注射器，針頭和鑷子；計時器 、75％乙醇噴霧瓶和紙巾卷，用于對表面和設(shè)備進行消毒；膠帶和用于標(biāo)記的永久性標(biāo)記記號筆；管架和廢物箱等。

細胞培養(yǎng)所需的基本試劑

 細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)

對于細胞存活和生長，至關(guān)重要的是培養(yǎng)環(huán)境盡可能復(fù)制細胞的生理環(huán)境。可以控制的培養(yǎng)條件包括溫度、相對濕度和二氧化碳含量，以及與培養(yǎng)基相關(guān)的因素，例如營養(yǎng)成分、pH、分子滲透摩爾濃度以及補料的體積和使用頻率。這些變量會隨時間波動，因此應(yīng)對其 進行監(jiān)視。下表3突出顯示了大多數(shù)哺乳動物細胞培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件，但有些細胞確實存在例外。

大多數(shù)哺乳動物細胞的最佳細胞培養(yǎng)條件

原代細胞與永生細胞

原代細胞培養(yǎng)是直接從完整或分離的組織或器官片段中分離并在培養(yǎng)皿中生長的細胞。首次將原代培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)后，它就被稱為細胞系。原代細胞系的壽命有限，在達到衰老狀態(tài)（細胞分裂停止）之前只能傳代培養(yǎng)10至20次。

一些細胞系的壽命沒有限制，并且具有無限的增殖能力。這些細胞系被稱為連續(xù)的或永生的細胞系。細胞的永生化可以多種方式發(fā)生。癌細胞具有固有的突變，使細胞能夠不受限制地繁殖。最初具有有限壽命的正常細胞可以通過促進生長的基因突變而轉(zhuǎn)化為永生化細胞。通過化學(xué)處理或引入可激活生長促進基因的致瘤病毒，也可使在培養(yǎng)物中生長的正常細胞永生。下圖1顯示了從原代到轉(zhuǎn)化后連續(xù)細胞系的進化以及每個階段的理論細胞產(chǎn)量。

原代細胞到連續(xù)細胞系的進化和理論細胞產(chǎn)量

 細胞培養(yǎng)冷凍保存和復(fù)蘇

細胞系是寶貴的資源，因此保存庫存以進行長期存儲至關(guān)重要。冷凍保存是指在非常低的溫度下冷卻和保存細胞以保持其生存能力的過程。細胞庫適合在低于-130°C的溫度下長期保存。

冷凍保存培養(yǎng)細胞的最佳方法是在冷凍保護劑（例如DMSO）存在的情況下，將它們保存在完全培養(yǎng)基中的液氮中。防凍劑降低培養(yǎng)基的凝固點，還可以降低冷卻速度，從而大大降低形成冰晶的風(fēng)險，而冰晶可能損壞細胞并導(dǎo)致細胞死亡。細胞應(yīng)以高濃度（例如90％融合時）和最早的傳代次數(shù)進行冷凍保存。簡而言之，冷凍保存包括洗滌和沉淀細胞，將其重懸于含有DMSO（例如5％DMSO）的完全培養(yǎng)基中，并將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至1mL無菌冷凍管中。由于細胞必須緩慢冷凍，因此將冷凍管放置在可控速率的冷凍室或冷凍室中。將冷凍冷凍的容器在-50至-80°C的溫度下儲存24小時，然后將冷凍管轉(zhuǎn)移到液氮儲存器中。

確切的冷凍條件取決于使用的細胞系。檢查特定于細胞系的條件非常重要，否則冷凍的種子細胞在復(fù)蘇和再培養(yǎng)時可能不會產(chǎn)生活細胞。

為了從液氮儲存中恢復(fù)細胞系，將冷凍的小瓶在便攜式液氮容器或干冰中運輸?shù)郊毎囵B(yǎng)區(qū)域。冷凍小管中的DMSO一旦融化，會對細胞產(chǎn)生毒性，因此，為確保高細胞活力，必須在37°C水浴中迅速融化細胞，并立即將其轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)熱培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基稀釋了DMSO，因此細胞不再處于有毒濃度。一旦復(fù)蘇的細胞繁殖并傳代兩次，它們就可以用于實驗。比較好的法是盡快冷凍儲存更多細胞，并更換長期存儲的細胞。

細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)

過程中的污染控制建議

在細胞治療產(chǎn)品（如CAR-T細胞）生產(chǎn)過程中，鑒于供體的可變性及可能含有傳染性疾病的病原體，且培養(yǎng)過程易導(dǎo)致污染，故尤其關(guān)注防止顆粒及微生物污染。特別是在細胞治療產(chǎn)品上游的關(guān)鍵工藝，在設(shè)計工藝流程時，建議設(shè)計一個封閉的、或功能封閉的制造過程，以降低產(chǎn)品污染的風(fēng)險。在細胞治療產(chǎn)品的整個生產(chǎn)過程中，對潔凈環(huán)境的控制、一次性系統(tǒng)的使用、對生產(chǎn)及培養(yǎng)設(shè)備的選擇等更是有著嚴(yán)格的合規(guī)要求。

 摒棄型工藝解決方案

首先，可選擇使用拋棄型工藝解決方案，可以降低微生物污染和交叉污染的風(fēng)險，滿足無菌化的要求。直接接觸細胞治療產(chǎn)品的無菌耗材應(yīng)當(dāng)盡可能使用一次性材料，并且所使用的耗材必須要經(jīng)過嚴(yán)格的篩選，在開展耗材適用性和生物安全性評估，以及基于風(fēng)險評估開展充分的耗材相容性和密封性的研究后，才能投入生產(chǎn)中使用。

 生產(chǎn)及培養(yǎng)設(shè)備污染防控

再者，對于生產(chǎn)及培養(yǎng)設(shè)備來說，更加需要嚴(yán)格把關(guān)。比如設(shè)備的外表面應(yīng)易清潔，盡量沒有清潔死角，同時耐受消毒劑及滅菌劑；其次，設(shè)備使用時應(yīng)兼具產(chǎn)品及使用者的生物安全需求；最后設(shè)備運行過程和操作過程中，應(yīng)降低甚至避免對潔凈室的潔凈環(huán)境的影響，確保生產(chǎn)環(huán)境符合要求。

 生產(chǎn)及培養(yǎng)設(shè)備污染防控

置于產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)境中的CO2培養(yǎng)箱，可以為細胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境條件，保障產(chǎn)品的質(zhì)量。培養(yǎng)箱的開關(guān)門及排風(fēng)均會對其放置的周邊潔凈環(huán)境有一定影響，建議在前端設(shè)備選型時注意，并在設(shè)備進入到使用環(huán)境后注意維護及控制，從而保證設(shè)備不會對外部潔凈環(huán)境造成破壞。特別注意的是培養(yǎng)箱內(nèi)部的環(huán)境建議等同于B級潔凈環(huán)境，使得開閉門時內(nèi)外潔凈級別一致，同時設(shè)備運行過程散發(fā)的排風(fēng)顆粒應(yīng)在硬件設(shè)計上有所控制，使其滿足使用環(huán)境的需求。

BINDER為CRT細胞治療再添解決方案

自動可規(guī)模化、功能性封閉的新一代細胞制造工藝是未來發(fā)展趨勢，德國賓德為CRT細胞治療再添新方案。

BINDER CBF 是帶濕度調(diào)節(jié)功能的高端二氧化碳培養(yǎng)箱，適用于 GxP 環(huán)境中的所有敏感培養(yǎng)任務(wù)。即使是基于細胞并用多孔板進行的檢測，該產(chǎn)品也確保能夠獲得一致的結(jié)果。即使是在缺氧條件下的復(fù)雜培養(yǎng)環(huán)境或個性化生長環(huán)境，BINDER 培養(yǎng)箱憑借其豐富的選購件和附件產(chǎn)品也可輕松勝任。

基于現(xiàn)有的CBF系列，賓德針對細胞治療等特定用戶群推出了一款全新的蜂巢版CBF，該版本產(chǎn)品適用于細胞治療、基因治療或干細胞研究等有嚴(yán)苛要求的應(yīng)用場景。其為專供“細胞治療”的特別版本 CBF 260。此版本配置與配備 O2 控制系統(tǒng)的 CBF 260 相同，可選配8段分隔內(nèi)門。可以實現(xiàn)對細胞進行有效的分區(qū)管理，已降低培養(yǎng)環(huán)境對細胞的負(fù)面影響。并對潛在污染進行有效地控制。

該版本 CBF 260可監(jiān)控四個參數(shù) ：溫度、CO2 濃度和氧氣濃度以及相對濕度。其中濕度控制尤為重要，培養(yǎng)箱在開門后幾分鐘內(nèi)即可恢復(fù)理想的濕度環(huán)境，從而避免培養(yǎng)介質(zhì)發(fā)生不必要的蒸發(fā)。

從靈活性中獲益！

除了固定配置以外，所有 CB 和 CBF 型號產(chǎn)品均可靈活配置這款全新選購件“帶細胞治療分隔區(qū)的分隔式內(nèi)門”：無論是否配置濕度控制或 O2 控制的設(shè)備，亦或是尺寸型號為 56、170 或者 260 的產(chǎn)品均可選用。